REVEAL HIDDEN ISOFORM DIVERSITY AT SINGLE-CELL RESOLUTION

isoform 수준에서 세포 이질성을 이해하는 것은 기본 및 질병 연구 모두에 중요합니다. PacBio® HiFi는 단일 세포 바코드 및 UMI 정보와 함께 전체 길이의 RNA isoform의 서열을 분석하여 단일 세포 생물학에 대한 전례 없는 인사이트를 보여줍니다. short read는  유전자 수준 정보만 캡처할 수 있고 다른 long read  기술은 정확한 UMI(고유 분자 식별) 및 CBC(세포 바코드) 식별에 대한 정확도가 부족합니다. 

HiFi read만이 단일 세포 연구에서 isoform을 정확하게  검출할 수 있습니다. 또한 직교 (orthogonal) 시퀀싱 데이터나 바코드 수정등을 위한  복잡한 알고리즘이 필요하지 않습니다. 

HIFI SEQUENCING ADVANTAGE IN SINGLE-CELL RNA SEQUENCING

• Full-length isoform information 

• Accurate cell barcode and UMI detection 

• Variant detection

- 왜 single-cell RNA sequencing에 HiFi read를 활용하여야 할까요?- 

• 전체 길이의 isoform을 다 캡쳐 할 수 있을 만큼 긴 read 길이 
• 다양한 isoform 만큼  다양한 cell barcode와 UMI를 식별할 수 있는 높은 정확도 

Long reads reveal isoform differences across cell types. 

 MAS-Seq 방법은 Single-cell 플랫폼에서 생성된 cDNA 분자를 더 긴 단편으로 연결하여 처리량을 증가시키는 concatenation method로 Al'Khafaji et al.에 의해 개발되었습니다.  Concatenated  분자를  sequencing 하여  생성된 HiFi read는 생물정보학적으로 분해하여 본연의 분자로 되돌릴 수도 있습니다. 그 결과 처리량이 높아지고 sequencing 해야할 분량은 줄어듭니다. Reference 논문에서는 MAS-Seq 방법을 10x single cell library에 적용하여 short-read  single-cell RNA-Seq를 사용해서는  검출할 수 없는,  암과 연관된 특정 세포 유형과 관련된 고유한 isoform을 구별할 수 있음을 보여주었습니다. 

MAS-Seq 방법을 활용한 single-cell isoform sequencing으로 다음과 같은 결과를 얻을 수 있습니다.  

• Achieve a 16-fold throughput increase compared to a regular single-cell Iso-Seq library

• Move beyond gene counting to get full-length isoform information

• Characterize the full diversity of transcript isoforms at the single-cell level

• Reveal cell type-specific spliced isoforms and expressed variants 

<References >

Al'Khafaji et al., (2021) High-throughput RNA isoform sequencing using programmable cDNA concatenation. bioRxiv, 10.01.462818,  

doi:https://doi.org/10.1101/2021.10.01.462818 

VIDEO 

Broad Institute, Aziz Al’Khafaji 박사는 Multiplexed Arrays sequencing (MAS-Seq)을 이용하여 PacBio 플랫폼에서 full-length mRNA isoforms 의 sequencing potential을 극대화 시켰습니다.

MULTIPLEXED ARRAYS SEQUENCING 

▶Feature 

• Supports cDNA generated from 10x Chromium Next GEM Single Cell 3’ kit (v3.1) 

• 15-75 ng input cDNA 

• Target 3,000 to 10,000 cell library 

• 16-fold throughput increase compared to nonMAS-Seq methods 

• No orthogonal sequencing data required

▶Workflow