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2021-06-08 08:52:20

 

 

  

PacBio highly accurate long-read sequencing (HiFi) 활용하여
고해상도로 미생물의 게놈을 분석할 있습니다.

  



 

 

감염된 숙주 내에서 바이러스의 복제 경쟁이  진행되면서 복잡한 변종 혼합물이 생성됩니다 집단 내의 모든 변이를 분석하는 것은 진화, 유사종 역학, 약물 내성 면역 회피 등을  이해하는 중요합니다

 

매우 높은 정확도와 길이를 제공하는 PacBio HiFi 시퀀싱은 전체 genome에서 소수의 SNP 만으로 달라질 있는 변이를 구별 있습니다.

 

 

HiFi 시퀀싱은 최대 20kb 길이의 amplicon에서 99 % 이상의 정확한 read를 

제공하여 phase variant를 직접 감지합니다.

 

    - 복잡한 혼합물을 유사종 및 고유한 haplotype으로 분리

    - 커뮤니티 내 또는 지리적인 영역 전체에서 숙주 내 바이러스 집단의 진화 및

      계통을 추적

    - 면역 회피 또는 약물 내성과 관련된 minor variant 식별 및 정량

    - 대규모 바이러스 genome의 de novo assembly 완성 

 

  

 

Spotlight: SMRT Sequencing of full-length HIV envelope reveals complete compartmentalization of variants in brain versus all other tissues

 



Brese, R. L., et al. (2018)  Journal of Neurovirology


   

  • SMRT sequencing 기술은 번에 수천 개의 read 생성 있기 때문에

    뇌와 림프 조직에서 HIV 분리샘플 간의 관계를 연구 있는 좋은 기회를
    
제공합니다

    • 길이의 read 활용하여 신경 질환과 연관되어 있는 뇌의 differential selective
    pressure
발생하는 entire envelope gene 변화를 관찰 있었습니다.




미생물 군집이 어떻게 기능하고 환경과 상호 작용하는지에 대한 새로운 통찰력을 얻으려면 개선된 접근 방식이 필요합니다.
Long read sequencing 활용하여 full-length 16S sequencing 10kb HiFi read 수준의 분류 genome profiling, assembly  진행, 기능적으로 깊이 이해할 있습니다.


        

          Explore the microbial world with confidence 

 


    매우 정확하고 길이가  HiFi read single-molecule 수준으로 분석이 가능
    하므로, full-length 16S rRNA sequencing , shotgun metagenome profiling            
    metagenome profiling 적합합니다.

    - 경제적인 가격으로 full-length 16S rRNA sequencing 수행, 또는 균주
      수준에서 community 구성을 분석

    - 절감된 비용으로 효율적인 metagenome profiling 수행, HiFi read 에서
      6-8 개의 full-length gene 식별

    -  6Gb HiFi 데이터로 multiplexed human fecal sample에서 최대 20 개의 고품질
      metagenome –assembled genome (MAG) 생성- 후성 유전체 데이터를 활용하du
      밀접하게 관련된 균주의 contig plasmid 연관분석

    - 후성 유전체 데이터를 활용하여 밀접하게 관련된 균주의 contig plasmid 를 연관분석




 


Spotlight: Strain-level identification of bacterial communities 
with the unprecedented accuracy of PacBio full-length 16S sequencing

Callahan, B. J.,  et al. (2019). Nucleic Acids Research.


PacBio circular consensus sequencing DADA2 sample 추론 방법은 single nucleotide 수준에서 거의 0 가까운 오류율로 full-length 16S rRNA 유전자를 분석할 있습니다.

 미생물/metagenome workflow 성능을 평가하기 위해 다양한 크기와 세포벽 구성을 가진 gram negative   gram positive 박테리아와 효모로 구성된 모의 Communities  Zymo mock community 사용하여 DNA 추출하고 full-length 16S rRNA gene 영역을 증폭, PacBio SMRT library 제작하여 Sequencing 진행하였습니다.

 

▲ Flowchart of computational methodology   





▲  Abundances of full-length 16S rRNA gene amplicon sequence variants (ASVs) detected in the Zymo mock community


Callahan, B. J.,  et al. (2019). Nucleic Acids Research.

PacBio circular consensus sequencing DADA2 sample 추론 방법을 통한 고해상도 ASV 정보를 사용하여 뿐만 아니라 균주 수준으로  명확하게 식별 있습니다.
ASV mock community 8 bacterial strain 맞게 binning되어 그룹화 되었습니다.


Long reads and methylation profiles enable binning of metagenome assembly contigs and plasmids

DNA 메틸화 정보를 shotgun metagenome 분석에 통합하면 기존 방법을 보완하여 보다 정확한 sequence binning 가능합니다.

 

 

Beaulaurier, J., et al. (2017). Nature 

DOI: 10.1038/nbt.4037

 


SMRT sequencing에서 DNA methylation profiles DNA 중합 효소가 하나의 nucleotide에서 다른 위치로 이동하는 걸리는 시간을 측정하는 IPD (inter-pulse duration) 값을 사용하여 계산되어 집니다.

Methylation motifs microbial sample에서 host genome mobile genetic elements (MGE) 연결하고 metagenome strain-level resolution 향상 시킬 있습니다.

 


▲ Overview of metagenomic binning using DNA methylation detected in SMRT long reads

 


▲ Binning mouse gut microbiome sequencing data

 


이전에 특성화 되지 않았던 adult mouse gut microbiome 9 genome 대해 binning 방법을 적용하여, matching methylation profiles기반으로 8 개의 조립 MGE genome 연결 지었습니다.  또한, metagenomics sample에서 unassembled reads methylation profiles 사용하여 binning 있음을 보여줍니다.


Confident phylogeneti identification of uncultured prokaryotes 
through long read amplicon sequencing of 16S-ITS-23S rRNA operon. 


 

네가지 환경 sample에서 다양한 prokaryotes로부터 full?length 가까운 rRNA 

operon amplicons 대상으로 sequencing 하였습니다.

 

 • Archaeal SILVA 데이터베이스와 비교하여 많은 novel 것으로 추정되는 

archaeal 23S rRNA gene sequences 생성했습니다

 

 • 이러한 long amplicon (~ 1000 bp) 16S rRNA 유전자 단편을 통해 분류 학적 

   분류 중에 높은 resolution 보이며 short amplicon 비해 near full?length  

   16S 23S rRNA gene sequences 결합한 정보가 훨씬 확실한 phylogeny

   정보를 제공함을 보여주고 있습니다.

 

 


 

Captured archaeal (A) and bacterial (B) phylogenetic diversity in the environmental samples

 


▲ Separate comparisons for Archaea and bacteria data sets 

 

 

HiFi Reads Offer the Benefits of Short Reads and Long Reads 
in One Easy-to-Use Technology



HiFi read 모든 변이 유형을 감지할 있는 높은 정확도 (> 99.9 %) 가장 복잡한 유전체와 전체 전사체를 assemble하는데 필요한 충분히 길이(최대 25kb) 제공합니다.