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metagenome sequencing with PacBio HiFi reads

2020-11-04 13:04:54
 

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매우 정확한 long read, HiFi sequencing으로 single molecule 수준의  full-length 16S rRNA sequencing, shotgun metagenomic profiling 및 metagenome assembly  분석이 가능합니다.

  • Cost-effective metagenomic profiling  : 각각의 HiFi Read에서 별도의 assembly없이 6 ~8 개의 full-length gene을 식별할 수 있습니다.
  • 합리적인 가격의 full-length 16S sequencing으로  species  또는 strain 수준에서 community composition을 분석할 수 있습니다.
  • 15X coverage의 HiFi metagenome 데이터로 reference 수준의  assembly를 생성할 수 있습니다.
  • 밀접한 관계에 있는 균주의 contig 및 plasmid의 연관분석이 가능합니다.

 

 

METAGENOMIC SEQUENCING WITH HIFI READS
아래의 자료에서 좀더 자세한 내용을 살펴보실 수 있습니다.

 
 
 
 

    The HiFi Sequencing Advantage for Metagenome Assembly

Metagenome data의 assembly 및  binning은 많은 metagenome 분석 파이프 라인의 첫 번째 단계입니다. Metagenome Assembled Genome(MAG)과 Cicularized MAG(CMAG)는 완전한 유전자와 오페론의  분석을 가능하게 하여 대사 능력의 예측을 향상시킵니다. MAG는 또한 유전자 합성에 대한 정보를 제공하고 보다 향상된 분류학적 프로파일링 분석을  가능하게 합니다. 그러나 최근 리뷰에서 논의 된 바와 같이 completeness 가 떨어지거나 contamination 높은 MAG draft는  잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다.

 

 

High-error reads compromise the assembly of low abundance species

Metagenome assembly의 주요 장애물 중 하나는 동일한 샘플에 밀접하게 관련된 여러 균주 및 종이 존재한다는 것입니다. 이로 인해 assembly graph가  엉 키게 됩니다. Long read가 이러한 문제를 해결하는 데 도움이 되지만  sequencing data  자체가  가지고 있는  raw error 가  두 박테리아 종 간의 차이 (종종 3 %로 정의 됨) 보다 크면  assembly에 혼동을 주게 됩니다. 이는 noise가 많은 long read의 경우 assembly 전에 high  accuracy consensus read를 생성하기 위해 raw read를 서로 매핑하는 error correction 단계를 거치게 되기 때문입니다. Metagenome data를 사용할 때 실제로 다른 종에서 파생된 read들이 assembly에 영향을 줄 수 있습니다. 

 

Higher read accuracy drives assembly quality

높은 정확도와 긴 read 길이의  HiFi 데이터는 metagenome assembly 오랫동안 지속되어온 난제를 극복할 수 있는 가능성을 보여줍니다.  복잡한 커뮤니티에서 밀접하게 연관된 종을 정확하게 assemble하고 고품질 MAG와 CMAG를 생성하는 데 필요한 variation을  삭제할 수 있는 error correction 단계에 영향을 받지 않습니다. 또한, metagenome assembly에서 낮은 빈도로 존재하는  종의 분석을  개선할 수 있는 잠재력을 보여줍니다.  
HiFi 데이터는 이미  large genome assembly 프로젝트에  파장을 일으키고 있는데, 첫번째는 2020년 1월 발표된 PAGXXVIII에서, 그리고 최근에는 인간 게놈의 variant calling 방법을 평가한 precision FDA Truth Challenge V2에서 확인할 수 있습니다.

 
 
 
 
 
 

Spotlight: Strain-level identification of bacterial communities with the unprecedented accuracy of PacBio full-length 16S sequencing

 

 


DADA2 소프트웨어를 사용하여 16S  housekeeping 유전자의 모든 copy를  미생물 community에서 분석할 수 있습니다. 동일한 균주에서 파생된 16S 서열 변이는 각 genome의 copy수를 반영하는 정수 비율로 데이터에 나타납니다. 예를 들어 Zymo mock community에 존재하는  E. coli O157 : H7과 같은 경우 이 같은 고해상도 정보를 사용하여 종 뿐만 아니라 균주 수준에서 식별 할 수 있습니다.

 

* Callahan, B. J.,  et al. (2019). High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research.

 

Long reads and methylation profiles enable binning of metagenome assembly contigs and plasmids

 

 

Metagenome 의 SMRT sequencing은 community member들의 연속적인 assembly 를 가능하게 하고 더 나아가  관련 methylation 정보를 활용하여  보다 정확한 contig 를 구성할 수 있습니다. methylation fingerprint를 통해 plasmid와 숙주 간의 연관성을 분석할 수 있습니다. 

 

* Beaulaurier, J., et al. (2017). Metagenomic binning and association of plasmids with bacterial host genomes using DNA methylation. Nature Biotechnology, 36(1), 61–69.

 
 
 
 
 
 
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