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ASHG 2020에서 진행되었던 PacBio workshop 내용을 확인해보세요!

2020-11-18 15:42:28




 ASHG 2020에서 진행되었던 PacBio workshop 내용을 확인해 보세요!


ASHG PACBIO WORKSHOP: LATEST PRODUCT AND APPLICATION UPDATES

새로운 PacBio Sequel IIe 시스템이 어떻게 고도로 정확한 long-read sequencing을 쉽고 절감된 비용으로 진행할 수 있는지 확인하실 수 있습니다. 변이 검출을 위한 인간 WGS, de novo genome assembly, single-cell full-length RNA sequencing, PCR 및 No-Amp 방법을 사용한 targeted sequencing을 포함한 다양한 애플리케이션에 대한 업데이트를 제공합니다.





ASHG PACBIO WORKSHOP: APPLICATIONS OF THIRD GENERATION SEQUENCING IN UNSOLVED DISEASE

Emily G. Farrow, Ph.D., CGC
Director, Laboratory Operations - Genomic Medicine Center, Children’s Mercy Kansas City

어린이를 위한 Genomic Answers 연구에 long-read sequencing을 적용하여 새로운 유전 변이를 확인하고  진단 수율을 높이는 방법을 공유합니다. short-read sequencing만으로는 분석이 어려웠던 반복 영역과 큰 구조변이에 대해 PacBio HiFi sequencing을 적용하여 해결한 몇 가지 사례를 확인하실 수 있습니다. 






ASHG COLAB: PACBIO HIFI READS FOR COMPREHENSIVE CHARACTERIZATION OF GENOMES AND SINGLE-CELL ISOFORM EXPRESSION

ASHG Colab 세션에서는 HiFi read가 어떻게 게놈과 전사체 모두에 대한 포괄적인 변이 검출에 적용되는지를 보여주었습니다. 프로토콜 및 분석 방법의 개선으로 Variant calling의 확장성과 정확성이 어떻게 향상되었는지 설명합니다. precisionFDA Truth Challenge V2에서 입증 된 바와 같이, HiFi 읽기 (> 99 % 정확도, 15kb – 20kb)는 이제  single nucleotide 및 structural variant calling 및 small indel을 찾아내는 능력이  short –read 보다 뛰어납니다. 또한, Single-Cell RNA sequencing 경우 HiFi read를 사용하면 UMI 및 single cell barcode를 정밀하게 감지하는 동시에 전체 길이의 transcript isoform 정보를 확인할 수 있습니다. 모든 single cell 플랫폼에서 생성된 full-length cDNA는 PacBio 시스템에서 sequencing 할 수 있으며, Sequel II 시스템은 SMRT Cell 8M 당 최대 3 백만 개의 full-length read를 생성, 약 ~ 3,000 개의 단일 세포를 분석하기 충분합니다.
 




ASHG PACBIO WORKSHOP: SINGLE-CELL ISOFORM ANALYSIS OF THE NERVOUS SYSTEM

Tilgner, Hagen 
Weill Medical College of Cornell University


PacBio Long read를 Single cell RNA sequencing에 적용하여 뇌 조직에서 새로운 isoform 발현을 확인하는 방법을 공유합니다.
 






 

VIDEO POSTER: ACCURATE, COMPREHENSIVE VARIANT CALLING IN DIFFICULT-TO-MAP GENES USING HIFI READS

인간 유전체에 있는 약 5 %의 단백질 코딩 유전자에는 homologous pseudogene 이나 segmental duplication 으로 인해 짧은  NGS read 길이로는 매핑하기 어려운 엑손이 포함되어 있습니다. Long-read DNA sequencing은 homologous exon 과  이웃하고 있는 고유한  서열을 연결함으로써 매핑이 어려웠던 영역의 분석 가능성을 높일 수 있습니다. 최근 개발 된 HiFi read는 매핑하기에 충분히 긴 길이 (15kb – 25kb)와 변이를 확인할 수 있는 높은 정확도 (> 99 %)을 제공하여 분석수준을 높일 수 있습니다. 
 






 

VIDEO POSTER: A NEW APPROACH TO THALASSEMIA AND ATAXIA CARRIER SCREENING PANELS USING CRISPR-CAS9 ENRICHMENT AND LONG-READ SEQUENCING

PCR은 관심있는 영역을  증폭하여 sequencing하는데 있어 비용적으로 효율적인 방법이지만, GC 함량이 극도로 높은 영역 및  short tandem repeat (STR) 영역을 증폭하는데 어려움이 있고  sequence artifact가 발생하기 쉽습니다. CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여  amplification-free enrichment 방법을 개발(No-Amp Targeted Sequencing), 잠재적 PCR artifact를 배제하였습니다. 여러 타겟을 멀티플렉싱하는 것 외에도 하나의 실험에서 최소 20 개의 샘플을 멀티플렉싱하여 No-Amp Targeted Sequencing 방법을 비용적으로도 효율적인 옵션으로 만들었습니다.
 




VIDEO POSTER: HIGH-THROUGHPUT HIFI LIBRARY WORKFLOW FOR HUMAN WHOLE GENOME SEQUENCING ON THE SEQUEL II SYSTEM

Sequel II 시스템의 Sequencing chemistry 및 software가 업데이트 되어 99 % 이상의 정확도로 최대 25kb 길이의 매우 정확한 long read (HiFi read)를 생성 할 수 있습니다. 이러한 high quality HiFi read는 single nucleotide부터 structural variant에 모든 유형의 변이를 검출하기에 적합합니다. PacBio는 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르기까지 end-to-end solution을 제공합니다. 
이 포스터에서는 라이브러리 제작 단계에서의 어려움을 해결할 수 있는 대체 방법을 제시하고 있습니다. 1-2 µg의 human genomic DNA를 사용하여 샘플 당 20-fold genome coverage에 적절한 데이터를 생성하도록 workflow를 최적화했습니다.

 





 


VIDEO POSTER: LONG-READ SEQUENCING OF THE SARS-COV-2 GENOME AND THE HUMAN IMMUNE REPERTOIRE

SARS-CoV-2 게놈의 완전하고 정확한 시퀀싱은 항 바이러스 및 백신 연구에 중요한 돌연변이의 발견 및 역학 추적을 가능하게 합니다. 환자의 면역 레퍼토리를 시퀀싱하는 방식을 통해 중화 항체를 탐지하고 적응 면역 반응의 변이를 이해할 수 있습니다. 이 영상에서는 PacBio의 길고 매우 정확한 (HiFi)  read를 사용하여 회복된 환자의 말초 혈액 림프구 RNA에 있는 중화 항체를 식별할 수 있음을 확인하실 수 있습니다. 






 

VIDEO POSTER: CAPTURE LONG-READ ISOFORM SEQUENCING (ISO-SEQ) FOR UNCOVERING HUMAN ISOFORM DIVERSITY IN THE BRAIN AND CHARACTERIZING SARS-COV2 VIRAL RNAS

진핵 생물의 대부분의 유전자는 같은 유전자에서 출발하더라도 다양한 단백질 과 non-coding RNA를 갖는 alternative isoform을 갖게 됩니다. PacBio의 정확하고 긴 read를 활용하여 assembly나 inference 없이  전체 길이의 전사체를 분석할 수 있습니다. PacBio isoform sequencing (Iso-Seq) 방법은 바코드 방식을 사용하여 최대  10kb 길이의 전사체의 full-length sequence를 생성합니다.  Iso-Seq  방법은 gene annotation, 새로운 isoform 및  fusion transcript의 식별,  조직 및 세포 유형에 따른 isoform expression을 포함한 다양한 연구에 사용할 수 있습니다. probe-based enrichment 방법과 long read sequencing을 적용하여 SARS-CoV2 viral sequencing을 하는 방법에 대하여 확인하실 수 있습니다.